Tinción de Gram (Practica)

OBJETIVO: El alumno aplicara una técnica de coloración diferencial para la identificación de bacterias Gram positivas y Gram negativas.

Material                                                  

ü  Asa de platino

ü  Vaso de precipitado

ü  Aceite de inmersión

ü  portaobjetos

Equipó

ü  Microscopio

ü  Mechero de bunsen

ü  Autoclave

Sustancias colorantes

ü  Cristal violeta

ü  Solución decolorante alcohol acetona

ü  Safranina

ü  Yodo lugol

Procedimiento (técnica):

REALIZACIÓN DE FROTIS:

1)   colocar una pequeña gota de agua en el centro de una porta objetos limpios. Es necesaria muy poca cantidad de agua, por lo que se puede usar el asa de siembra, ya que en el extremo curvo de su filamento queda retenida una mínima gota de agua, que resulta suficiente.

2)   Flamear el asa de siembra, tomar, en condiciones asépticas, una pequeña cantidad del cultivo bacteriano en medio solido (solo tocar con el asa) y transferirlo a la gota de agua. Remover la mezcla con el asa de siembra hasta formar una suspensión homogénea que queda bastante extendida para facilitar su secado. Si la muestra se toma de un cultivo en medio líquido, no es necesario realizar los dos primeros pasos ya que basta con colocar y extender una gota de la suspensión bacteriana, que se toma con el asa de siembra, directamente sobre el portaobjetos.

3)   Esperar hasta que el líquido se evapore o acelerar su evaporación acercando la porta ala llama del mechero. En este caso hay que tener mucha precaución de no calentar demasiado el portaobjeto pues las células pueden deformarse o romperse.

Tinción de Gram

      I.        Realizar la preparación del frotis bacteriano como se explico en el paso anterior.

    II.        Teñir con cristal violeta {1minuto}.

   III.        Lavar con abundante agua el exceso de colorante.

  IV.        Cubrir con yodo lugol {1 minuto}.

   V.        Lavar con agua el exceso de lugol.

  VI.        Decolorar con alcohol-acetona o simplemente con alcohol hasta que la preparación deje de perder color {20 segundos}.

VII.        Lavar con abundante agua para eliminar el resto de disolvente.

VIII.        Teñir con safranina {1 minuto}.

  IX.        Lavar con agua para eliminar el colorante de contraste.

    X.        Secar la preparación.

  XI.        Examinar al microscopio con aceite de inmersión y fijándose sobre todo en el color de cada preparación.

Observaciones

El medio de cultivo se volvió de color azul y en él aparecieron líneas en forma de bolitas como de color negro-azul. 

En la realización del frotis solo se debe colocar una pequeña gota de agua en el portaobjetos.

Cuando se toma una pequeña cantidad de cultivo bacteriano (solo tocarlo), y se transfiere a la gota de agua, es necesario que se extienda con ayuda del asa recordar que solo se debe extender en forma circular u ovalada. 

 Se debe esperar a que el liquido se evapore para acelerar se evaporación se acerca al mechero con precaución de no calentar demasiado por que se pueden romperse o deformarse las células.

Cuando se tiñe con el cristal violeta (1 minuto)

 Al lavar con abundante agua la muestra queda de color morado o violeta.

Su color cambia a un naranja pero muy bajo.

Cuando se lava con agua su color queda de color rosado-naranja.

Al observar con el microscopio en el objetivo de inmersión se observo su forma que es cocobacilar y su color es naranja. Y es Gram negativa.

conclusión

Logramos aplicar una realización del frotis y las tres tinciones mas utilizadas en microbiología para la visualización de bacterias que son la tinción simple, la tinción de Gram y la tinción de ziehl-Neelsen.

CUESTIONARIO

1.- ¿Qué es un frotis?

R: Se denomina frotis a la extensión que se realiza sobre un portaobjetos de una muestra o cultivo con objeto de separar lo más posible los microrganismos, ya que si aparecen agrupados en la preparación es muy difícil obtener una imagen clara y nítida.

2-. ¿Con que finalidad se fija la muestra de microrganismos en el porta objetos?

R: Para poder aplicar los métodos habituales de tinción que permiten la observación al microscopio de las bacterias sin que la muestra sea arrastrada en los sucesivos lavados. La fijación de una extensión bacteriana hace que las bacterias queden inactivadas y adheridas al vidrio alterando lo menos posible la morfología y bacteriana y las posibles agrupaciones de células que pudiera haber.

3.- ¿Qué importancia tiene teñir las muestras bacterianas?

R: La tinción bacteriana tiene dos propósitos fundamentales:

     Identificar la bacteria (Gram positiva o Gran negativa). Además tincionar las bacterias es importante para poder verlas en el microscopio, dependiendo el tipo de bacterias se tinciona de cierta manera siguiendo un protocolo.

 4.- ¿Por qué es necesario emplear aceite de inmersión para la observación de los microrganismos?

R: Los objetivos de aceite inmersión son usados para la observación objetivos muy pequeños, como las bacterias individuales y aplicaciones de alta resolución, como el TIRF y las aplicaciones de fluorescencia confocal.

5.- de los reactivos que utilizaste para la tinción de Gram, ¿Cuál es el que funciona como colorante primario?

R: cristal violeta.

6.- ¿Qué función tiene el yodo en la tinción de Gram?

R: funciona como fijación de la preparación, y también actúa sobre la pared de las bacterias Gram (+) de tal manera que al agregar el decolorante (alcohol-cetona) no se destiñan las bacterias que ya se tiñeron, al agregar la Safranina, las restantes bacterias se teñirán, siendo estas ultimas Gram (-).

7.- ¿Qué coloración tiñen las bacterias Gram negativas?

R: de un azul oscuro o violeta.

8.- ¿Qué coloración tiñen las bacterias Gram negativas?

R: de un color rosado tenue.

9.- menciona tres bacterias que tiñen Gram positivas y escribe la enfermedad que causa cada una de ellas.

R: Erisipelotricosis: es una infección cutánea de lento desarrollo causada por la bacteria Erysipelothrix rhusiopathiae.

Listeriosis: es una enfermedad causada por Listeria monocitogenes, da lugar a una sintomatología diversa de acuerdo con el lugar en que se produce la infección y la edad de la persona afectada. En el ser humano, la listeriosis puede afectar a casi cualquier órgano del cuerpo.

Ántrax: es una enfermedad causada por la bacteria Bacillus anthracis, que puede infectar la piel, los pulmones y el aparato gastrointestinal. El ántrax es una enfermedad muy contagiosa y potencialmente mortal.

10.- menciona tres bacterias que tiñen Gram negativas y escribe la enfermedad que causa cada una de ellas.

Haemophilus influenzae: es un cocobacilo Gram-negativo es responsable de un amplio rango de enfermedades como meningitis, epiglotis, neumonía, sepsis y otras de menor gravedad.

Escherichia coli: puede causar infecciones intestinales y extra intestinales generalmente graves, tales como infecciones del aparato excretor, cistitis, meningitis, peritonitis, mastitis, septicemia y neumonía Gram-negativa.

Salmonella enteritidis: La salmonelosis humana es una enfermedad infectocontagiosa producida por enterobacterias del género Salmonella. Comprende un conjunto de cuadros clínicos cuya principal manifestación es la gastroenteritis aguda, una de las intoxicaciones alimentarias más comunes causadas por agua y alimentos contaminados.